Introduzione del prodotto

Le cellule competenti DH5 α prodotte dalla nostra azienda sono preparate utilizzando un processo speciale dal ceppo DH5 α Escherichia coli e possono essere utilizzate per la trasformazione chimica del DNA. Utilizzando il rilevamento del plasmide pUC19, l'efficienza di trasformazione può raggiungere 108 e l'efficienza di trasformazione rimane invariata dopo essere stata immagazzinata a -70 ℃ per 3-5 mesi.

genotipo: supE44∆lacU169(φ80 lacZ∆M15)hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1

Caratteristiche del prodotto

Un ceppo inibitore difettoso ricombinante utilizzato per la posa e la coltivazione di plasmidi e piastre di argilla. Il prodotto del suo gene φ 80 lacZ ∆ M15 può raggiungere la β - complementarità con l'ammino terminale della β - galattosidasi codificata dal vettore pUC e può essere utilizzato per lo screening di macchie bianche e blu.

Metodo operativo(Le seguenti operazioni sono effettuate secondo gli standard delle condizioni sterili)

1. Mettere le cellule competenti sul ghiaccio per fondersi, usando 100ul di cellule competenti come esempio nel seguente esperimento.

2. Aggiungere il DNA bersaglio alla sospensione cellulare competente per la trasformazione, assicurando che il volume del DNA bersaglio non superi un decimo del volume della sospensione cellulare competente. Ruotare delicatamente il tubo centrifugo per mescolare il contenuto e metterlo in un bagno di ghiaccio per 30 minuti.

3. Posizionare il tubo della centrifuga in un bagno d'acqua 42 ℃ per 60-90 secondi, quindi trasferirlo rapidamente in un bagno di ghiaccio e lasciarlo riposare per 2-3 minuti, facendo attenzione a non scuotere il tubo della centrifuga.

4. aggiungere 500ul di SOC sterile e antibiotico libero o LB medium al tubo della centrifuga e agitare a 37 ℃ e 180rpm per 1 ora. Lo scopo è quello di esprimere i geni marcatori di resistenza rilevanti sul plasmide e ravvivare le cellule batteriche.

5. Prendere una quantità appropriata di cellule competenti trasformate e rivestirle su piastre SOC o LB contenenti antibiotici corrispondenti. Invertire e coltivare a 37 ℃ per 12-16 ore. La quantità di rivestimento può essere regolata in base ad esperimenti specifici: ad esempio, se la quantità totale di DNA trasformato è grande, circa 100ul del prodotto trasformato può essere utilizzato per rivestire la piastra; Al contrario, se la quantità totale di DNA trasformato è piccola, 200-300ul del prodotto trasformato può essere rivestito sulla piastra. Un eccesso di liquido batterico può inibire la crescita batterica. Se ci sono meno cloni attesi, una parte del mezzo di coltura può essere rimossa mediante centrifugazione e le cellule batteriche possono essere sospese e rivestite su una piastra. La soluzione batterica rimanente può essere conservata a 4 ℃. Se il numero di colonie trasformate il giorno successivo è troppo basso, la soluzione batterica rimanente può essere rivestita su una nuova piastra.

questioni che richiedono attenzione

1. le cellule sensoriali dovrebbero essere immagazzinate a -70 ℃ e non dovrebbero essere congelate o scongelati ripetutamente, altrimenti la loro efficienza di trasformazione diminuirà.

Il processo sperimentale deve essere rigorosamente sterile, per prevenire l'inquinamento di altri DNA o germi, per evitare l'impatto sul screening e l'identificazione successivi.

Durante la trasformazione, l'efficienza di trasformazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di DNA esterno in una certa gamma, ma quando l'aggiunta di una quantità eccessiva di DNA esterno o un volume troppo grande riduce invece l'efficienza di trasformazione. Il volume del DNA durante la trasformazione è inferiore a un decimo del volume delle cellule sensoriali.

Calcolo del tasso di conversione: tasso di conversione = numero totale di colonie / quantità totale di DNA della piastra.

Per evitare che l'esperimento di conversione non abbia successo, è possibile conservare una parte del prodotto di connessione per riconvertire e ridurre al minimo le perdite.